空間トランスクリプトーム解析 Visium HD

空間オミックス解析の1種である空間トランスクリプトーム解析法は、3つのタイプに大別されます。手法ごとに得られる結果が大きく異なるため、研究目的に合わせて最適な手法を選択することが重要となります。

①関心領域（ROI）タイプ
レーザーやUVなどで選択した組織切片上の関心領域について、通常のRNA-seq（トランスクリプトーム）解析を実施する手法です。病変部や腫瘍部などの関心領域における、バルク（集団の平均値）の網羅的な発現情報を取得可能です。しかしながら、個々の細胞の発現情報や空間的な位置情報を得ることはできません。

②スポットタイプ  ＞
基盤上に配置したスポット単位で、網羅的な遺伝子発現解析を実施する手法です。空間的な位置情報を保持しながら遺伝子発現解析が可能です。空間分解能の違いにより複数のタイプに分けられます。ひとつはVisium^*1で、スポットのサイズやスポット間の距離により、1スポットに数十個程度の細胞が含まれたり、解析されない細胞が一定数生じるタイプです。もうひとつはVisium HD^*1で、細胞とほぼ同サイズのスポットで、スポット間の隙間のない高解像度タイプです。これらのタイプは研究目的や予算により適切な使い分けが必要です。

③シングルセルタイプ  ＞
組織切片上のRNAを１分子ごとに検出し細胞境界情報と併せて解析することで、1細胞ごとにトランスクリプトーム解析を実施する手法です。個々の遺伝子が発現する位置（組織内の細胞）と量を計測する遺伝子発現解析ができます。通常の（空間情報を含まない）シングルセル解析の結果を基に注目する遺伝子を選択し、それらの遺伝子（細胞）の空間情報を取得することを主な目的に使用します。網羅的な遺伝子発現解析も可能ですが、検出遺伝子数については数百～数千遺伝子と網羅性に関してはまだ課題もあります。

HE染色像とスポットごとに取得した発現情報との比較

HE染色像とスポットごとに取得した発現情報との比較

マウス腎臓組織は組織学的に、Cortex(皮質)、Outer medulla(外髄質)、Inner medulla(内髄質)の3つの領域で構成されていることが知られています（左図）。スポットごとに発現情報を取得した組織切片上で、各領域での発現が知られている遺伝子の発現分布を表示しました（右図）。

スポットのクラスタリング結果と各スポットに特徴的な遺伝子発現

スポットのクラスタリング結果と各スポットに特徴的な遺伝子発現

各スポットの遺伝子発現プロファイルを基に各スポットをクラスタリングし、その結果をUMAPにより二次元上にプロットしました（左図）。１つの点が1つのスポットを示します。各クラスタに特徴的な遺伝子の発現量と発現割合をドットプロットで図示しました（右図）。縦軸は遺伝子、横軸は各クラスタに対応しています。発現量をドットの色の濃淡で、発現しているスポットの割合をドットの大きさで示しました。

各クラスタの発現変動遺伝子(Heatmap)

各クラスタの発現変動遺伝子(Heatmap)

各クラスタで特徴的な遺伝子をヒートマップを用いて可視化しました。縦軸は遺伝子、横軸は各クラスタに対応しています。各クラスタ内には、そのクラスタに属するスポット1つひとつが表されています。発現量が多い遺伝子は赤色、少ないものは青色で示しました。

各スポットの組織切片像へのマッピング結果

各スポットの組織切片像へのマッピング結果

各スポットをクラスタリング結果に基づいて色分けし、位置情報に従って組織切片像に割り当てました。

各クラスタの組織切片像へのマッピング（クラスタ毎）

各クラスタの組織切片像へのマッピング（クラスタ毎）

各クラスタを組織切片像に割り当てた結果を、クラスタ毎に表示しました。発現プロファイルやその他の解析結果を基に、各クラスタに属するスポットで主要な細胞タイプを推定しました。推定した細胞タイプは、組織学的に知られている領域と類似した分布を示していました。

各クラスタに特徴的な遺伝子の発現分布

各クラスタに特徴的な遺伝子の発現分布

各クラスタに特徴的な遺伝子の発現量を、ヒートマップで表示しました。発現量が高いスポットほど赤色で表示しました。

各クラスタに特徴的な遺伝子の発現分布(Violin plot)

各クラスタに特徴的な遺伝子の発現分布(Violin plot)

各クラスタに特徴的な遺伝子の発現量をバイオリンプロットで表示しました。縦軸は各遺伝子の発現量、横軸はクラスタ、バイオリン型の幅は密度分布（プロットされたスポットの密度）を示しています。このようにVisium HDで取得した高解像度で網羅的な発現情報に基づくスポットの分類結果は、組織学的な特徴を反映し、かつ各領域に特徴的に発現する遺伝子を同定することが可能です。

がん組織のHE染色像と各スポットの発現プロファイルに基づいた各領域の分類結果

がん組織のHE染色像と各スポットの発現プロファイルに基づいた各領域の分類結果

各スポットの網羅的な発現情報（発現プロファイル）に基づいてスポットをクラスタリングし、各スポットの位置情報に従ってHE染色像（左図）に各スポットを割り当てると、形態学的特徴や空間的配置との対応が見られました（右図）。HE染色像から判断した線維化領域を▲で示しています。クラスタ１（C1）は、 HE染色像から判断した線維化領域に対応していました。

スポットのクラスタリング結果と各スポットに特徴的な遺伝子発現

スポットのクラスタリング結果と各スポットに特徴的な遺伝子発現

各スポットのクラスタリング結果をUMAPにより二次元上にプロットしました（左図）。１つの点が１つのスポットを示します。各点には各スポットの発現プロファイルが紐づいており、発現が類似しているほど各点は基本的には近くに配置されます。各クラスタで特徴的な遺伝子の発現量と発現割合をドットプロットで図示しました（右図）。縦軸は遺伝子、横軸は各クラスタに対応しています。遺伝子の発現量をドットの色の濃淡で、遺伝子を発現しているスポットの割合をドットの大きさで示しました。

線維化領域に特徴的な遺伝子の発現

線維化領域に特徴的な遺伝子の発現

病理切片上のクラスタ1（C1：線維化領域）を茶色に表示しました（左図）。 HE染色像から判断した線維化領域を▲で示しています。また、線維化領域で特徴的に発現する遺伝子の発現量をバイオリンプロットで図示しました（右図）。線維化に関連する遺伝子が、C1で特徴的に発現していました。尚、C6は平滑筋細胞が多く存在する領域と推定され、線維化領域とは区別しています。

TGFβシグナル伝達関連遺伝子の発現分布

TGFβシグナル伝達関連遺伝子の発現分布

線維化に関与することが知られているTGFβシグナルの関連遺伝子の発現量を、HE染色像上にヒートマップで示しました。いずれの遺伝子も、C1で特徴的に発現していました。また、 TGFβは免疫抑制性サイトカインとしてもよく知られています。そこで次に、その他の免疫抑制シグナル伝達経路についても検討しました。

免疫抑制シグナル伝達関連遺伝子群の発現分布（スコアリング表示）

免疫抑制シグナル伝達関連遺伝子群の発現分布（スコアリング表示）

腫瘍には制御性T細胞（Treg）や腫瘍関連マクロファージなどの免疫抑制に関与する細胞が存在し、抗腫瘍免疫応答の抑制に関与することが知られています。免疫抑制に関わるシグナル伝達経路に関連する遺伝子群の発現量をスコアリングして、ヒートマップで示しました。スコアが高い（スポットが赤色）ほど、各シグナル伝達関連遺伝子群の発現量が高いことを示します。線維化領域（▲）では、免疫抑制に関わるシグナル伝達経路が活性化していると考えられます。

スポット型の空間トランスクリプトーム解析では、空間情報が紐づけられた遺伝子発現解析により、組織学的特徴と発現プロファイルを対比することや、組織学的には明瞭に識別しにくい領域を発現プロファイルによって分類し特徴付けることが可能です。

非小細胞肺がんに含まれる細胞タイプ

非小細胞肺がんに含まれる細胞タイプ

短期間に薬剤抵抗性を獲得したがん（ER：early resistance)と長期間を要したがん（LR：long term resistance)の薬剤投与前のVisium HDデータから細胞ごとの発現プロファイルを推定した後、以降の解析を実施しました。発現プロファイルの類似度に基づいて細胞をクラスタリングした結果をUMAPで示しました（左図） 。各細胞タイプに特徴的な遺伝子の発現をバイオリンプロットで示しました（右図） 。縦軸は遺伝子、横軸は細胞タイプを示します。がん細胞は３種類（Tc_SCG3A1 ： SCG3A1高発現腫瘍細胞、Tc_TMSB4X ： TMSB4X高発現腫瘍細胞、Tc_MMP7：MMP7高発現腫瘍細胞）に分類されました。

各ニッチを構成する細胞タイプの割合

各ニッチを構成する細胞タイプの割合

非小細胞肺がんを構成する細胞の空間的な分布からニッチを同定しました。グラフの縦軸は各ニッチを構成する細胞タイプの割合を合計１として表示し、横軸はニッチを示しています。３種類のがん細胞のそれぞれを含むCN2(Tc_MMP)、CN3(Tc_TMSB)、CN5(Tc_SCGB)など６種類のニッチに分類されました。

短期耐性獲得例（ER)と長期耐性獲得例（LR)における各ニッチの割合と分布

短期耐性獲得例（ER)と長期耐性獲得例（LR)における各ニッチの割合と分布

ERおよびLRそれぞれのがん組織におけるニッチの空間分布を示しました。図中のそれぞれの点は細胞を示しており、ニッチごとに色分け表示しました。 ERおよびLRのニッチの構成比をグラフに示しました（右図） 。グラフの縦軸はそれぞれのがん組織を構成するニッチの割合を合計１として表示し、横軸はERおよびLRを示します。ERでは、MMP7およびTMSB4Xを高発現するがん細胞を多く含むCN2、CN3の割合が高くなっていました。

組織におけるニッチと細胞タイプの分布

組織におけるニッチと細胞タイプの分布

がん組織におけるニッチの空間分布（上段）と、各ニッチに含まれる細胞タイプの空間分布（下段）を示しました。図中のそれぞれの点は細胞を示しており、ニッチおよび細胞タイプごとに色分け表示しました。ニッチの分布からは、領域ごとの特徴をより俯瞰して把握することが可能です。

マクロファージにおけるニッチによる遺伝子発現の差

マクロファージにおけるニッチによる遺伝子発現の差

TAM (tumor associated macrophage) で発現が増加するCTSL、およびマクロファージに特徴的に発現するMSR1の発現量を示しました（左図）。マクロファージを比較的多く含むCN3、CN4、CN5について、マクロファージにおけるMSR1、CTSLの発現量をニッチごとに示しました（右図）。ERに多く見られるCN3ではCTSLの発現量が増加しているのに対し、正常組織と考えられるCN4、LRに多く見られるCN5ではCTSLの発現量増加は見られませんでした。ERの細胞ニッチは、薬剤投与前の時点で既にマクロファージに対する影響が異なる可能性が考えられました。