シングルセル空間トランスクリプトーム解析

空間オミックス解析の1種である空間トランスクリプトーム解析法は、3つのタイプに大別されます。手法ごとに得られる結果が大きく異なるため、研究目的に合わせて最適な手法を選択することが重要となります。

①関心領域（ROI）タイプ
レーザーやUVなどで選択した組織切片上の関心領域について、通常のRNA-seq（トランスクリプトーム）解析を実施する手法です。病変部や腫瘍部などの関心領域における、バルク（集団の平均値）の網羅的な発現情報を取得可能です。しかしながら、個々の細胞の発現情報や空間的な位置情報を得ることはできません。

②スポットタイプ
基盤上に配置した1スポット単位で、遺伝子発現解析を実施する手法です。空間的な位置情報を保持しながら、網羅的な遺伝子発現解析が可能です。ただ、スポットのサイズやスポット間の距離により、1スポットに数十個程度の細胞が含まれたり、解析されない細胞が一定数生じます。近年、細胞とほぼ同サイズのスポットで、スポット間の隙間のない高解像度タイプも登場しています。スポットサイズやスポット間の距離に関わらず、取得した発現情報がスポット内のどの細胞に由来するかは特定できません。

③シングルセル/1分子タイプ
組織切片上のRNAを１分子ごとに検出し、細胞境界情報と併せて解析することで、シングルセルまたはサブセル（1細胞以下）レベルで、トランスクリプトーム解析を実施する手法です。個々の遺伝子が発現する位置（組織内の細胞や細胞内局在）と量を計測する遺伝子発現解析ができます。ただ現時点では、検出遺伝子数は数百～数千遺伝子であり、解析可能な臓器も限られるため、網羅性や汎用性についてはまだ課題も残っています。

クラスタリング結果　(497,763cells, UMAP)

クラスタリング結果　(497,763cells, UMAP)

高次元のデータである各細胞の網羅的な発現情報（発現プロファイル）を、情報のロスを極力抑えつつ低次元に変換しました。さらに、発現プロファイルに基づいて細胞をクラスタリングし、その結果をUMAP^*2により二次元上にプロットしました。1つの点が1個の細胞を示します。各点には細胞の発現プロファイルが紐づいており、発現が類似しているほど各点は基本的には近くに配置されます。

各細胞タイプに特徴的な遺伝子発現（Dot plot）

各細胞タイプに特徴的な遺伝子発現（Dot plot）

各細胞タイプに特徴的な遺伝子の発現量と発現細胞割合をドットプロットで図示しました。縦軸は遺伝子、横軸は各細胞タイプに対応しています。発現量をドットの色の濃淡で、発現している細胞の割合をドットの大きさで示しました。

クラスタリング結果の空間座標へのマッピング

クラスタリング結果の空間座標へのマッピング

クラスタリング結果に基づいて細胞を色分けし空間上にプロットすることで、組織中の各細胞タイプの分布を可視化しました。1つの点が1個の細胞を示します。

クラスタリング結果の空間座標へのマッピング（細胞タイプ毎）

クラスタリング結果の空間座標へのマッピング（細胞タイプ毎）

クラスタリング結果を細胞タイプごとに色分けして表示しました。

肺腺がん微小環境における腫瘍細胞および制御性T細胞（Treg）の局在

肺腺がん微小環境における腫瘍細胞および制御性T細胞（Treg）の局在

各細胞の位置情報と細胞境界線情報を基に、肺腺がん組織における上皮細胞（腫瘍細胞）とTregの分布を図示しました。また、上皮細胞、Tregの各マーカーであるEPCAM（中段左図）、FOXP3とCTLA4（下段）、さらに、TregのFOXP3の発現を誘導し免疫抑制作用を促進するAREG（中段右図）の発現量をヒートマップで示しました。発現量が高い細胞は赤色、低い細胞は白色で表示しました。 AREGは主に腫瘍細胞に発現が見られ、Tregはその細胞の周囲に局在していました。

AREGおよびFOXP3 RNA分子の空間上での発現分布

AREGおよびFOXP3 RNA分子の空間上での発現分布

AREGおよびFOXP3の細胞内局在をRNA1分子レベルでプロットしました（右図）。この様にシングルセル空間トランスクリプトーム解析法では、組織内の細胞の種類と分布を明らかにでき、また、各細胞タイプに特徴的に発現する遺伝子やその遺伝子（RNA分子）の細胞内局在も検出することが可能です。関心領域タイプやスポットタイプといった他の空間トランスクリプトーム解析法では実現できない解析です。

解析の概略図

解析の概略図

補完したデータによるクラスタリング結果　(40,864 cells, UMAP)

補完したデータによるクラスタリング結果　(40,864 cells, UMAP)

シングルセルRNA-seqデータで補完したシングルセル空間トランスクリプトームデータを用いて、遺伝子発現プロファイルに基づいて細胞をクラスタリングし、その結果をUMAPにより二次元上にプロットしました。1つの点が1個の細胞を示します。

各細胞タイプに特徴的な遺伝子の発現分布

各細胞タイプに特徴的な遺伝子の発現分布

各細胞タイプで特徴的に発現している遺伝子の発現分布を図示しました。これらの発現プロファイルやその他の解析をもとに、各クラスタの細胞タイプを推定しました。

クラスタリング結果の空間座標へのマッピングによる各細胞タイプの局在

クラスタリング結果の空間座標へのマッピングによる各細胞タイプの局在

各細胞の位置情報と細胞境界線情報を基に、組織における各細胞タイプの局在を図示しました。上図は組織切片上の一部の領域を示します。

各遺伝子の空間（組織切片）上での発現分布

各遺伝子の空間（組織切片）上での発現分布

各細胞タイプに特徴的な遺伝子の発現量を、ヒートマップで表示しました。発現量が高い細胞は赤色、低い細胞は白色で示しました。

血管内皮細胞と推定されたクラスタの再クラスタリング結果（4,900 cells, UMAP）

血管内皮細胞と推定されたクラスタの再クラスタリング結果（4,900 cells, UMAP）

全細胞のクラスタリング結果から、血管内皮細胞と推定された細胞集団を抽出した後、再度クラスタリングを行いました。

HSPCマーカー遺伝子の発現分布

HSPCマーカー遺伝子の発現分布

造血幹・前駆細胞（HSPC）で特徴的に発現している遺伝子の発現分布を図示しました。このようにシングルセルRNA-seqデータで補完することで、検出遺伝子数が限られるシングルセル空間トランスクリプトーム解析でも、より高感度に希少な細胞集団を検出することが可能です。

HSPC近傍における血管内皮細胞のエンリッチメント

HSPC近傍における血管内皮細胞のエンリッチメント

再クラスタリングにより検出したHSPCを、組織切片上に射影し、HSPC近傍に存在する細胞タイプを可視化しました。左図は組織切片上の特定の領域について表示し、白枠で囲った領域を右図で拡大表示しています。多くのHSPCは、血管内皮細胞と隣接して存在していることが観察されました。EC：血管内皮細胞、HSPC：造血幹・前駆細胞

クラスタリング結果　(27,894 cells, UMAP)

クラスタリング結果　(27,894 cells, UMAP)

各細胞の発現プロファイルに基づいて細胞をクラスタリングし、その結果をUMAPにより二次元上にプロットしました。細胞を分類することで、組織内にどのような特徴をもった細胞が存在するかを明らかにできます。

クラスタリング結果の空間座標へのマッピング

クラスタリング結果の空間座標へのマッピング

クラスタリング結果に基づいて細胞を色分けし空間上にプロットすることで、組織中の各細胞タイプの分布を可視化しました。

各遺伝子の発現分布

各遺伝子の発現分布

特徴的な遺伝子の発現分布を、クラスタリング結果上（左図）または空間上（右図）に図示しました。左図では、着目する遺伝子が特徴的に発現するクラスタ（細胞タイプに相当）を視覚的に確認できます。一方、右図では、着目する遺伝子が発現している細胞の組織内局在を確認することが可能です。

各RNA分子の空間上での発現分布

各RNA分子の空間上での発現分布

各遺伝の発現量と発現位置を、RNA１分子レベルで空間座標にプロットしました。マウス嗅球における各細胞層のマーカー遺伝子をRNA1分子レベルで可視化し、さらに嗅覚受容体（Olfactory receptor）のRNA分子を黒点で表示しました。その結果、各嗅覚受容体の遺伝子は、組織内において特徴的な局在を示しました。マウス嗅覚受容体遺伝子には約1,000種類ほどがありますが、同じ種類の嗅覚ニューロン（Olfactory sensory neuron）には、その内の1種類の嗅覚受容体が特異的に発現します。また、同じ種類の嗅覚ニューロンは、同一の糸球体に集束します。従って、組織内において１分子単位で嗅覚受容体RNAの発現位置を明らかにし、同じ嗅覚受容体分子が局在する領域を特定することにより、糸球体の存在する位置が推定できます。

このように1細胞レベルに加え、RNA1分子レベルでの空間トランスクリプトーム解析により、これまで困難であった生命現象を明らかにすることが期待されます。