ご相談対応事例 | シングルセル解析
事例１： 解釈不能な1次解析結果から、研究目的に沿った解釈可能な結果の取得を支援
お客様の課題
薬剤刺激ありと刺激なしの2群のマウスPBMC（末梢血単核球）間で、特定の細胞タイプで発現量に差のある遺伝子を同定したいが、以下の2点で困っています。
- ① 大きなクラスタに複数の細胞タイプが含まれる
- ② 2群の細胞タイプ同士がUMAP上で異なる場所に位置
ジエンブルの対応プロセス
１．研究目的とご要望のヒアリング
ご要望の詳細を確認するため、専用フォームへのご記入と参考文献のご提供を依頼しました。参考文献による研究背景の確認と独自に研究内容に関連する知見を調査した上で、1時間程のWEBミーティングを実施しました。守秘義務厳守の下で、研究計画における当解析の位置づけ、目的詳細、仮説、ご希望の解析内容を確認後、解析データ一式のご提出をお願いしました。
２．マッピング結果および1次解析結果の確認
研究目的に沿って取得した発現データや解析結果であるか、以下の点について確認しました。
- ・各解析工程の手法や条件の確認
- ・マッピング結果の各指標の確認
- ・1次解析結果の生物学的視点からの検証
３．確認結果のご報告と解析方針のご提案
確認結果についてご報告後、打ち合わせを通じて以下の方針で解析作業の実施を決定しました。
- 【 確認結果 】
- ・ライブラリ調製とシーケンスは、多少ばらつきはあるものの必要な品質と量が確保されていた
- ・データクリーニングや各種補正が適正に実施されていない為、目的の結果を取得できていない
- ・適切な前処理の実施と解析手法・条件の検討により、目的の結果を取得できる可能性が高い
- 【 解析方針 】
- ・各検体に合わせた前処理の実施により、解析結果に影響を及ぼすノイズを除去
- ・解析に不適切な細胞や遺伝子の除去、発現データ補正、実験間誤差補正
- ・クラスタリング手法の変更と条件の最適化
- ・統計検定法の変更による2群間の発現変動遺伝子の抽出精度の向上
４．解析経過のご説明（中間報告の実施）
以下の点についてご報告し、現時点で研究目的や仮説を考慮した解析結果を取得できていることをご確認頂きました。
- ・前処理条件の最適化により2群を比較可能なクラスタリング結果を取得
- ・細胞タイプ推定の結果、目的の細胞は2つの細胞タイプA、Bから構成
５．解析結果説明、結果解釈のサポートおよび今後の解析方針（最終報告の実施）
WEBミーティングを実施し、以下の点について打ち合わせを実施しました。
- 【 解析結果および解釈サポート 】
- ・2群間で細胞タイプA、Bの比率が大きく変化
- ・薬剤の作用機序から予想される発現変動遺伝子と同様の遺伝子を検出
- ・さらに既知情報からは予想されない発現変動遺伝子も検出
- 【 今後の解析方針 】
- ・2群間の遺伝子発現変化に関連する生命現象の推定
- ・細胞タイプAとBの細胞割合に影響を及ぼす細胞間シグナルの推定
成果
解析条件が最適化されていない為に解釈できなかった結果を、適切な条件で再解析することで生物学的に解釈可能な結果を取得できました。更に、研究目的および使用薬剤の作用機序から、関連が予測される遺伝子を発現変動遺伝子から抽出してご報告することで、先回りして研究をサポートしました。
お客様からのフィードバック
解釈できずに諦めかけていた結果から生物学的に納得できる結果が得られた点について、非常にご満足頂きました。また、研究目的を踏まえてウェット実験を含む解析全体を最適化することの重要性をご説明したところ、データ解析だけでは研究目的を達成できないことが大いにあり得ることをご理解頂けました。次回は「実験を始める前にまずご相談します」とお声を頂きました。
事例２：目的に応じた実験デザイン策定で、最小コストで最大限の結果取得と解釈を支援
お客様の課題
ヒトの疾患原因遺伝子を特定しKOマウスを作成したところ、ホモ欠損は胚性致死でした。原因遺伝子の異常によってある細胞の分化異常が見られることから、シングルセル解析によりそのプロセスを解析しようと考えましたが、全く経験がない分野のため実験全体のデザインから相談したい。
- 【 課題 】
- ① 解析対象組織は、「マウス全胚」または「原因細胞が分化する組織」のいずれにするべきか？
- ② KOは胚性致死であるが、胚発生のどの時期に対象組織を採取するべきか？
- ③ KO胚は個体差が大きいがn数はどうするべきか？
ジエンブルの対応プロセス
１．研究目的とご要望のヒアリング（事前打ち合わせの実施）
ご要望の詳細を確認するため、守秘義務厳守の下、専用フォームへのご記入と参考文献のご提供を依頼しました。ご提供資料による研究背景を確認し、関連する知見を調査した上で、1時間程度のWEBミーティングを実施しました。ミーティングでは、研究計画におけるシングルセル解析の位置づけ、目的の詳細、仮説、ご希望の解析内容を確認しました。
２．主な課題に対する解決策のご提案
- ① 原因細胞が分化する組織の解析で主要な研究目的は達成可能
- ② 胚の状態変化のタイミングから推定した適切な検体採取時期
- ③ 個体差の評価は重要でないため、複数の胚から採取した組織をプールして細胞を単離
- ④ 発現比較を行う細胞タイプの組合わせは、細胞のクラスタリング後に決定
３．細胞調製サポート
細胞調製方法についてご説明した後、予備実験を実施頂きました。細胞数、生細胞率、顕微鏡像等を含む予備実験結果を基に、細胞単離条件の最適化、死細胞除去の有無、最適な検体のご提出方法についてサポートしました
４．解析結果説明、結果解釈のサポートおよび今後の解析方針（最終報告の実施）
WEBミーティングを実施し、以下のご報告とサポートを行いました。
- 【 解析結果および解釈サポート 】
- ・WT/KOで各分化段階の細胞割合を比較すると、特定の分化段階以降ではKOの細胞割合が減少
- ・WT/KOで割合が変化した細胞の群間DEGから、分化異常に関わる可能性のある遺伝子群を抽出
- 【 今後の解析方針 】
- ・分化異常の解析に適切な分化段階の細胞を選択して、WT/KO間の発現変動遺伝子を抽出
- ・WT/KO間の発現変動遺伝子が関連すると推定される生命現象を俯瞰
- ・原因細胞の分化経路推定を実施
- ・推定された経路上での遺伝子発現変化をWTとKO間で比較
成果
お客様の研究目的と生物学的背景情報から、必要十分な条件で解析をデザインすることで、最小コストで最大限の解析目的を達成できました。更に、追加の発現比較解析では、解析結果とお客様の生物学的興味に応じた比較組合せをご提案して実施し、研究をサポートしました。
お客様からのフィードバック
全体を通じて、ウェット研究者の感性を踏まえた実験デザインをご提案した点をご評価頂きました。また、個々の生物学的な課題ごとに必要なデータ解析プランをご提案したことで、お客様の研究テーマの重要な課題を中心に予算を投入して解析を進めることが出来た点についてもご満足頂けました。
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